PC工艺表征支原体污染检测

　　1.     支原体检测方法概述
　　PC工艺表征支原体污染严重干扰细胞实验结果，检测有无支原体污染的方法较多，可以根据自身实验室条件、检测方法便捷性等作出选择。
　　①电子显微镜或相差显微境观察。用扫描电镜或透射电镜，直观观察支原体形态。或者在细胞培养瓶内预置盖玻片，接种细胞在盖玻片上，培养24小时后取出用油镜观察。如有支原体，因支原体与细胞在不同平面，可发现支原体呈现暗色颗粒装。
　　缺点：设备要求严格，检测成本高，不适合普通实验室日常常规检测。
　　②DNA荧光染色法，利用支原体没有细胞膜（壁）的特性，用荧光染料Hoechst 33258染色， Hoechst 33258能与支原体DNA结合着色，在荧光显微镜下观察，呈现绿色小点。缺点：灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污染。
　　③固体培养法，用支原体培养基大量增殖支原体，是相对可靠的支原体检测技术。缺点：耗时长，需要数周时间才能得到结果，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测。此外，该方法不能检测猪鼻支原体，因为猪鼻支原体不能在固体培养基上形成可见的菌落，猪鼻支原体（M.Hyorhinis）约占所有支原体污染的20-50%。
　　④PCR法，提取细胞培养液，提取支原体，制备样品，根据支原体高度保守的16SrRNA序列设计引物（避免真核细胞或细菌DNA干扰），设置阴性，阳性对照，扩增产物经电泳后成像观察，可识别已发现的几乎全部100余种支原体。
　　⑤Quick Cell快速检测法，拓扑酶环化支原体DNA，在根据高保守区设计的引物引导下，采用特殊等温DNA扩增酶，61℃条件下，连续滚环式扩增支原体DNA 60分钟，根据有无支原体污染，随着扩增进程可目视实验结果。
　　⑥化学发光法，裂解支原体后，有底物情况下，支原体特异性的酶，能将ADP转化成ATP。ATP参与荧光素酶（Luciferase）催化底物荧光素（Luciferin）产生光的过程，所以可以通过催化底物荧光素导致的生物发光（Bioluminescence）信号来判别支原体DNA存在与否。
　　综上所述，在多种支原体检测方法中，受实验条件、实验时长、便捷性等因素限制,①-④仅在很少情况下得到应用。实际科研工作中，应用最为广泛的是 ⑤ PCR支原体检测法；⑥Quick Cell快速支原体检测法；⑦化学发光支原体检测法。nscriptprobio.cn/add-antibody-affinity-支原体污染检测